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《上海海洋大学》 2018年
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尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白乳酸菌活载体口服疫苗的研制及其免疫效果无极1登录

蔡玉臻  
【摘要】:罗非鱼是我国重要的养殖品种之一,在我国南方广泛养殖。2009年以来我国南方主养区罗非鱼大范围暴发链球菌病,链球菌病的主要病原有海豚链球菌(Streptococcus iniae)和无乳链球菌(S.agalactiae)。目前针对罗非鱼无乳链球菌病尚无科学有效的防治措施,主要依赖抗生素类化学药物进行防治,易导致菌株耐药和药物残留。疫苗具有安全、高效、无残留等优点,可替代抗生素类药物成为罗非鱼链球菌病防控的重要途径。目前已有无乳链球菌灭活疫苗、减毒疫苗、DNA疫苗和基因工程亚单位疫苗等多种疫苗的报道,但其具有一定的局限性,使之不能进行大面积的推广。研制免疫方便、效果较好、易于工业化生产的新型疫苗已经成为防控罗非鱼链球菌病的主要趋势。本无极1登录构建了重组表达无乳链球菌表面免疫原性蛋白(Surface immunogenic protein,Sip)的乳酸菌穿梭表达质粒,制备成乳酸菌活载体疫苗,通过灌胃口服的方式对其免疫原性进行了无极1登录。无极1登录内容和结果如下:1尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip基因穿梭表达质粒的构建及原核表达构建重组表达无乳链球菌Sip蛋白的分泌型穿梭表达质粒pNZ8124-Sip和非分泌型穿梭表达质粒pNZ8148-sip,通过酶切和测序验证后电转化乳酸乳球菌NZ9000,获得能够诱导重组表达无乳链球菌Sip蛋白的乳酸乳球菌。采用SDS-PAGE电泳摸索最佳诱导浓度和诱导时间以获得最大表达量,通过镍柱纯化目的蛋白并进行Western blot检测。无极1登录结果显示:构建的分泌型重组乳酸乳球菌可通过nisin诱导表达大小为48KDa的特异性蛋白,非分泌型的表达蛋白为45KDa,与目的蛋白大小一致;SDS-PAGE电泳显示重组蛋白主要以胞内可溶性蛋白和包涵体2种形式存在,其中胞内可溶性蛋白浓度达7.65 mg/mL;诱导表达的最佳条件为100 ng/mL nisin诱导6 h;Western blot检测结果显示,诱导蛋白可与鼠抗His标签抗体特异性结合。本无极1登录成功构建了尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白非分泌型乳酸乳球菌NZ9000-pNZ8148-sip和分泌型菌株NZ9000-pNZ8124-sip,并诱导表达出大量的胞内可溶性Sip蛋白,为尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白乳酸菌活载体疫苗的制备提供了条件,为下一步的免疫原性检测奠定了基础。2尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白乳酸菌活载体疫苗免疫原性无极1登录为了探究尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白乳酸菌活载体疫苗免疫原性,本无极1登录将重组菌在最佳诱导条件下获得NZ9000-pNZ8124-sip、NZ9000-pNZ8148-sip重组菌分别以不同浓度(2.24×10~9 CFU/mL(低浓度组)、2.24×10~(10) CFU/mL(中浓度组)和2.24×10~111 CFU/mL(高浓度组))灌胃口服免疫尼罗罗非鱼,对照组分别灌胃口服等剂量的2.24×10~(10) CFU/mL的NZ9000-pNZ8124、NZ9000-pNZ8148和NZ9000菌株以及PBS溶液。隔周免疫1次,共免疫2次。第1次免疫后第1、2、4、8、16和21d采集各组罗非鱼血清样本,通过试剂盒方法检测超氧化物歧化酶(SOD)活力、碱性磷酸酶(AKP)活力及溶菌酶(SOD)活性变化情况;采用间接ELISA法测定免疫后血清抗体水平变化;采集免疫后各组罗非鱼的胸腺、肝、脾和肠组织,通过荧光定量PCR方法检测其免疫相关基因IgT、IgM、CD8a、C3的相对表达量;首次免疫后第21d采用无乳链球菌腹腔注射人工感染各组罗非鱼,获得其相对免疫保护率(relative percent survival,RPS)。结果表明,分泌型和非分泌型重组乳酸菌活载体疫苗口服免疫后,中浓度组第一次免疫后IgT、IgM、CD8a、C3基因在胸腺、肝、脾脏、肠组织中的相对表达量均上调表达,随着时间的推移呈现下调趋势,第二次免疫后再次出现上调表达;攻毒前(第一次免疫后第21d)分泌型和非分泌型活载体疫苗中浓度组罗非鱼血清中的溶菌酶、超氧化物歧化酶(SOD)活力和碱性磷酸酶(AKP)活力均显著高于PBS组。罗非鱼的血清抗体水平分泌型和非分泌型乳酸菌疫苗的NZ9000组、空载体组、NZ9000-8148-sip低浓度组和NZ9000-8124-sip高浓度组与PBS组无显著性差异;中浓度NZ9000-8124-sip(2.24×10~(10) CFU/mL)和低浓度NZ9000-8124-sip(2.24×10~9 CFU/mL)与PBS组有显著性差异,且随着时间推移呈现先增加后降低的趋势,分别在16d和4d达到峰值,中浓度组的抗体水平要高于低浓度组。无乳链球菌人工感感染实验结果表明,口服免疫2次能够显著提高罗非鱼抗无乳链球菌感染能力,中浓度免疫组的相对免疫保护率最高为41.0%。罗非鱼的血清抗体水平非分泌型表达载体组的中浓度NZ9000-8148-sip(2.24×10~(10) CFU/mL)和高浓度NZ9000-8148-sip(2.24×10~(11) CFU/mL)与PBS组有显著性差异,且随着时间推移呈现先增加后降低的趋势,均在第21d达到峰值,中浓度组的抗体水平要高于低浓度组。免疫2次能够显著提高罗非鱼抗无乳链球菌感染能力,中浓度免疫组的相对免疫保护率最高为61.6%。从整体的免疫效果分析非分泌型活载体疫苗的效果要优于分泌型。本无极1登录可为罗非鱼链球菌病口服疫苗的无极1登录奠定基础,具有广阔的应用前景。
【学位授予单位】:上海海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S948

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