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《上海海洋大学》 2018年
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尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白乳酸菌活载体口服疫苗的研发及其免疫效果研讨

蔡玉臻  
【摘要】:罗非鱼是我国重要的饲养种类之一,在我国南边广泛饲养。2009年以来我国南边主养区罗非鱼大范围爆发链球菌病,链球菌病的首要病原有海豚链球菌(Streptococcus iniae)和无乳链球菌(S.agalactiae)。现在针对罗非鱼无乳链球菌病尚无科学有用的防治办法,首要依靠抗生素类化学药物进行防治,易导致菌株耐药和药物残留。疫苗具有安全、高效、无残留等长处,可代替抗生素类药物成为罗非鱼链球菌病防控的重要途径。现在已有无乳链球菌灭活疫苗、减毒疫苗、DNA疫苗和基因工程亚单位疫苗等多种疫苗的报导,但其具有必定的局限性,使之不能进行大面积的推行。研发免疫便利、效果较好、易于工业化出产的新式疫苗已经成为防控罗非鱼链球菌病的首要趋势。本研讨构建了重组表达无乳链球菌外表免疫原性蛋白(Surface immunogenic protein,Sip)的乳酸菌络绎表达质粒,制备成乳酸菌活载体疫苗,经过灌胃口服的办法对其免疫原性进行了研讨。研讨内容和成果如下:1尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip基因络绎表达质粒的构建及原核表达构建重组表达无乳链球菌Sip蛋白的排泄型络绎表达质粒pNZ8124-Sip和非排泄型络绎表达质粒pNZ8148-sip,经过酶切和测序验证后电转化乳酸乳球菌NZ9000,取得可以诱导重组表达无乳链球菌Sip蛋白的乳酸乳球菌。选用SDS-PAGE电泳探索最佳诱导浓度和诱导时刻以取得最大表达量,经过镍柱纯化意图蛋白并进行Western blot检测。研讨成果显现:构建的排泄型重组乳酸乳球菌可经过nisin诱导表达巨细为48KDa的特异性蛋白,非排泄型的表达蛋白为45KDa,与意图蛋白巨细共同;SDS-PAGE电泳显现重组蛋白首要以胞内可溶性蛋白和包容体2种方法存在,其间胞内可溶性蛋白浓度达7.65 mg/mL;诱导表达的最佳条件为100 ng/mL nisin诱导6 h;Western blot检测成果显现,诱导蛋白可与鼠抗His标签抗体特异性结合。本研讨成功构建了尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白非排泄型乳酸乳球菌NZ9000-pNZ8148-sip和排泄型菌株NZ9000-pNZ8124-sip,并诱导表达出很多的胞内可溶性Sip蛋白,为尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白乳酸菌活载体疫苗的制备供给了条件,为下一步的免疫原性检测奠定了根底。2尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白乳酸菌活载体疫苗免疫原性研讨为了探求尼罗罗非鱼无乳链球菌Sip蛋白乳酸菌活载体疫苗免疫原性,本研讨将重组菌在最佳诱导条件下取得NZ9000-pNZ8124-sip、NZ9000-pNZ8148-sip重组菌别离以不同浓度(2.24×10~9 CFU/mL(低浓度组)、2.24×10~(10) CFU/mL(中浓度组)和2.24×10~111 CFU/mL(高浓度组))灌胃口服免疫尼罗罗非鱼,对照组别离灌胃口服等剂量的2.24×10~(10) CFU/mL的NZ9000-pNZ8124、NZ9000-pNZ8148和NZ9000菌株以及PBS溶液。隔周免疫1次,共免疫2次。第1次免疫后第1、2、4、8、16和21d收集各组罗非鱼血清样本,经过试剂盒办法检测超氧化物歧化酶(SOD)生机、碱性磷酸酶(AKP)生机及溶菌酶(SOD)活性改变状况;选用直接ELISA法测定免疫后血清抗体水平改变;收集免疫后各组罗非鱼的胸腺、肝、脾和肠安排,经过荧光定量PCR办法检测其免疫相关基因IgT、IgM、CD8a、C3的相对表达量;初次免疫后第21d选用无乳链球菌腹腔打针人工感染各组罗非鱼,取得其相对免疫维护率(relative percent survival,RPS)。成果表明,排泄型和非排泄型重组乳酸菌活载体疫苗口服免疫后,中浓度组第一次免疫后IgT、IgM、CD8a、C3基因在胸腺、肝、脾脏、肠安排中的相对表达量均上调表达,跟着时刻的推移出现下调趋势,第2次免疫后再次出现上调表达;攻毒前(第一次免疫后第21d)排泄型和非排泄型活载体疫苗中浓度组罗非鱼血清中的溶菌酶、超氧化物歧化酶(SOD)生机和碱性磷酸酶(AKP)生机均明显高于PBS组。罗非鱼的血清抗体水平排泄型和非排泄型乳酸菌疫苗的NZ9000组、空载体组、NZ9000-8148-sip低浓度组和NZ9000-8124-sip高浓度组与PBS组无明显性差异;中浓度NZ9000-8124-sip(2.24×10~(10) CFU/mL)和低浓度NZ9000-8124-sip(2.24×10~9 CFU/mL)与PBS组有明显性差异,且跟着时刻推移出现先添加后下降的趋势,别离在16d和4d到达峰值,中浓度组的抗体水平要高于低浓度组。无乳链球菌人工感感染试验成果表明,口服免疫2次可以明显进步罗非鱼抗无乳链球菌感染才能,中浓度免疫组的相对免疫维护率最高为41.0%。罗非鱼的血清抗体水平非排泄型表达载体组的中浓度NZ9000-8148-sip(2.24×10~(10) CFU/mL)和高浓度NZ9000-8148-sip(2.24×10~(11) CFU/mL)与PBS组有明显性差异,且跟着时刻推移出现先添加后下降的趋势,均在第21d到达峰值,中浓度组的抗体水平要高于低浓度组。免疫2次可以明显进步罗非鱼抗无乳链球菌感染才能,中浓度免疫组的相对免疫维护率最高为61.6%。从全体的免疫效果剖析非排泄型活载体疫苗的效果要优于排泄型。本研讨可为罗非鱼链球菌病口服疫苗的研讨奠定根底,具有宽广的使用远景。
【学位颁发单位】:上海海洋大学
【学位等级】:硕士
【学位颁发年份】:2018
【分类号】:S948

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